一、保健食品中脂溶性维生素分析方法概况
保健食品中添加有维生素A、维生素D、维生素E、维生素K和b－胡萝卜素，一般情况下后两者使用相对较少 。鉴于脂溶性维生素的特点和样品基质情况，样品一般需要在皂化后经有机溶剂提取后测定。
1．维生素A
一般添加视黄醇醋酸酯和视黄醇棕榈酸酯两者之一或两种均添加。通常情况下成分复杂的样品需采用皂化反应后测定其中的视黄醇。成分相对简单的片剂和胶囊样品可采用溶剂提取直接测定视黄醇醋酸酯或视黄醇棕榈酸酯。奶粉等产品可以使用胰酶或蛋白酶处理，溶剂提取后测定视黄醇醋酸酯或视黄醇棕榈酸酯。
2．维生素E
一般情况下添加的是a－维生素E。成分相对简单的样品可采用溶剂提取直接测定。多数样品需要在皂化反应后测定其中的维生素E。
同时分析维生素E 4种结构并包括内标物，可使用如下正相柱：
（1）Nucleosil-NH2 4.6×250mm, 5μm，正己烷：二恶烷=85：15，295nm
（2）Zorbax SIL 4.6×250mm, 5μm，正己烷：二恶烷：异丙醇=985：10：5，295nm
（3）Lichrosorb-NH2 4.0×250mm，5μm，正己烷：异丙醇=99：1，295nm
（4）YMC－Pac A－600 （NH2），3μm，正己烷：异丙醇=98：2 Ex：290nm Em：325nm
3.维生素D
一般情况下添加的是维生素D2和维生素D3中之一。目前维生素D的分析尚不如维生素A和维生素E成熟，主要原因为含量低，前处理过程损失多，与维生素E较难分离。现在采取的方法是采用乙腈＋甲醇＋水＝25+75+4作为流动相，根据样品中维生素D的情况，选择维生素D2和维生素D3互为内标。维生素D的分析对于色谱柱的要求较高，一般来讲250mm长度的Zobax SB-C18 比较适合分析要求。
4.b－胡萝卜素
b－胡萝卜素一般出现在植物性保健食品中，分析方法相对成熟。目前我们将维生素E、番茄红素和b－胡萝卜素通过采用不同的波长达到一次性分析的目的。样品采用二氯甲烷进行提取，分析过程需要加入抗氧化剂BHT对组分进行保护。
流动相为甲醇：乙腈＝50：50
色谱柱：Supelcosil RP C18
5.α－胡萝卜素
α－胡萝卜素目前也出现在保健食品中已有应用，初步将其与b－胡萝卜素一同分析。样品采用丙酮进行提取。
流动相为甲醇：甲基叔丁基醚：水＝310：76：14
色谱柱：Symmetry C18
检测波长：450nm
二．保健食品中水溶性维生素分析方法概况
目前建立并推广了一套的系统分析方法，通过选用多波长离子对高效液相色谱分析可以解决维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺、维生素C的分析。生物素、泛酸、叶酸需采用单独的高效液相色谱分析条件。维生素B2采用荧光分光光度法分析。
1．维生素B1（盐酸硫胺、硝酸硫胺）
分析维生素B1可采用盐酸苯海拉明作为内标。样品采用甲醇+水+磷酸提取。
流动相为硫酸月桂酯钠溶液（5g/530mL）：乙腈：磷酸＝530：470：0.4
色谱柱：m-Bondapak C18或TSK Gel-C18
检测波长：260nm
2.维生素B1（呋喃硫胺）
有报道，呋喃硫胺是维生素B1的活性结构，在韩国、日本等产品中使用呋喃硫胺与盐酸硫胺、硝酸硫胺的色谱行为有较大区别。
流动相为甲醇：水：乙酸：PigB6＝450：530：20：20
色谱柱：m-Bondapak C18
检测波长：280nm
3.维生素B6（吡哆醇）、烟酸、烟酰胺
分析维生素B6、烟酸、烟酰胺可采用愈创木酚甘油醚作为内标。样品采用甲醇+水+磷酸提取。
流动相为1－癸烷磺酸钠溶液（1.22g/850mL）：乙腈：磷酸＝850：150：0.4
色谱柱：m-Bondapak C18或TSK Gel-C18
在维生素类保健食品中烟酸应用极少，基本上添加的均为烟酰胺。
检测波长：280nm
功能性饮料中添加的咖啡因和苯甲酸也可以同时检测。根据大量实验认为液体类样品应使用TSK Gel-C18，固体样品两者皆可。
4.维生素C
除颜色较深、含量较低、天然植物干制品外，一般样品中的维生素C均可以采用碘溶液滴定法进行测定。利用高效液相色谱法测定维生素C可利用维生素B6（吡哆醇）、烟酸、烟酰胺流动相体系，因维生素C色谱保留时间较短，可以将降低其中乙腈的比例至5%。提取溶剂尽可能使用水，以避免在前面出现倒峰影响定量结果的准确。
检测波长：254nm
5.维生素B2
有关维生素B2的色谱分析方法有报道，但在实际样品分析过程中因保留时间较短且与其它峰难以较好分离，故采用将其转化为光黄素后进行荧光分光光度法分析。
6.泛酸（维生素B3）
泛酸采用液相色谱分析法进行检测，样品用水提取即可。
流动相：0.02M磷酸二氢钾溶液：乙腈=95：5，pH=3.0
色谱柱： m- Bondapak C18 300mm
检测波长：200nm
7.生物素
生物素的分析正在初步摸索阶段，目前采用pH=3.5 0.25M磷酸盐缓冲溶液：甲醇=77：23的流动相，检测波长200nm。 目前的需要解决的问题是保留时间较长，大约在30min左右；此外灵敏度较低。
8.叶酸
叶酸一般使用弱碱性水溶液提取，为保证提取效果可以在50℃水浴中加热10min。
流动相：磷酸二氢钾缓冲溶液：甲醇=460:40，pH=6.0
色谱柱： m- Bondapak C18 300mm
检测波长：280nm
叶酸的研究方向：通过大量实际样品检测研究，发现在虫草等天然产物中存在与叶酸色谱保留时间完全一致的物质；不少样品中叶酸含量较低，拟采用固相萃取等技术作为前处理手段。
9.维生素B12
维生素B12的化学分析目前还是一个难题，对于含量较高，组成简单的原料和添加剂进行高效液相色笱单的原料和添加剂进行高效液相色失杂的多种维生素样品的分析方法正在摸索之中。
维生素B12的研究进展：虽然维生素B12有3个特征波长，但样品在不经处理的情况下也很难分析；在溶液中钴胺素很容易出现氰钴胺素、甲钴胺素、羟钴胺素等几种形式共存的现象。为避免出现上述问题，更好地去除样品中的干扰杂质并对样品中的维生素B12进行富集，目前采用加入表面活性物质、盐析、有机溶剂萃取等方法去除杂质，再通过固相萃取法进行富集的手段。
三、类维生素分析方法概况
1.肉碱（维生素BT）
肉碱若采用分光光度法检测比较繁杂，高效液相色谱法测定相对简单。利用高效液相色谱法测定肉碱同样利用维生素B6（吡哆醇）、烟酸、烟酰胺流动相体系，因肉碱色谱保留时间虽比维生素C长但相对仍较短，因此流动相可以同维生素C一样。提取溶剂尽可能使用水或pH=5~6的水，以避免在前面出现倒峰影响定量结果的准确。
检测波长：210nm
2.辅酶Q10
对于维生素类样品中辅酶Q10的检测采用液相色谱分析法。样品中辅酶Q10使用正己烷作为提取溶剂。
色谱柱：TSK Gel-C18
流动相：乙腈+四氢呋喃+水=55+40+5
检测波长：280nm
3.肌醇
对于维生素类样品中肌醇的检测建立了一套衍生化-气相色谱分析法。样品中肌醇经过提取，彻底去除水分后进行衍生化，正己烷提取后进行气相色谱分析。
衍生化试剂：三甲基氯硅烷：六甲基二硅氨烷：二甲基甲酰胺=1：2：8
色谱柱：BP-5弹性石英毛细管柱, 25m×0.32mm
色谱条件：载气 50mL/min
尾吹气 50 mL/min
氢气 40 mL/min
空气 500 mL/min
分流比 1：50
四、需要解决的问题及展望
1．解决样品前处理技术
（1）不少油性胶囊样品中加入了水溶性维生素，如何应用前处理手段解决提取、净化问题。
（2）对于含量较低的样品如何应用固相萃取等手段。
（3）对于目前原料微囊化制作技术如何应对。
2．解决色谱多组分分析技术
在目前现有的多组分分析技术的基础上，如何能将维生素B1并入维生素B6系列之中或创建新的流动相体系，再囊括维生素B2和叶酸等是今后研究的重要方面。
3. 解决分析过程快速化
在目前大量样品检测的基础上应归纳总结出样品前处理方法指南，确定样品组成和前处理方法之间的关系。
保健食品中添加有维生素A、维生素D、维生素E、维生素K和b－胡萝卜素，一般情况下后两者使用相对较少 。鉴于脂溶性维生素的特点和样品基质情况，样品一般需要在皂化后经有机溶剂提取后测定。
1．维生素A
一般添加视黄醇醋酸酯和视黄醇棕榈酸酯两者之一或两种均添加。通常情况下成分复杂的样品需采用皂化反应后测定其中的视黄醇。成分相对简单的片剂和胶囊样品可采用溶剂提取直接测定视黄醇醋酸酯或视黄醇棕榈酸酯。奶粉等产品可以使用胰酶或蛋白酶处理，溶剂提取后测定视黄醇醋酸酯或视黄醇棕榈酸酯。
2．维生素E
一般情况下添加的是a－维生素E。成分相对简单的样品可采用溶剂提取直接测定。多数样品需要在皂化反应后测定其中的维生素E。
同时分析维生素E 4种结构并包括内标物，可使用如下正相柱：
（1）Nucleosil-NH2 4.6×250mm, 5μm，正己烷：二恶烷=85：15，295nm
（2）Zorbax SIL 4.6×250mm, 5μm，正己烷：二恶烷：异丙醇=985：10：5，295nm
（3）Lichrosorb-NH2 4.0×250mm，5μm，正己烷：异丙醇=99：1，295nm
（4）YMC－Pac A－600 （NH2），3μm，正己烷：异丙醇=98：2 Ex：290nm Em：325nm
3.维生素D
一般情况下添加的是维生素D2和维生素D3中之一。目前维生素D的分析尚不如维生素A和维生素E成熟，主要原因为含量低，前处理过程损失多，与维生素E较难分离。现在采取的方法是采用乙腈＋甲醇＋水＝25+75+4作为流动相，根据样品中维生素D的情况，选择维生素D2和维生素D3互为内标。维生素D的分析对于色谱柱的要求较高，一般来讲250mm长度的Zobax SB-C18 比较适合分析要求。
4.b－胡萝卜素
b－胡萝卜素一般出现在植物性保健食品中，分析方法相对成熟。目前我们将维生素E、番茄红素和b－胡萝卜素通过采用不同的波长达到一次性分析的目的。样品采用二氯甲烷进行提取，分析过程需要加入抗氧化剂BHT对组分进行保护。
流动相为甲醇：乙腈＝50：50
色谱柱：Supelcosil RP C18
5.α－胡萝卜素
α－胡萝卜素目前也出现在保健食品中已有应用，初步将其与b－胡萝卜素一同分析。样品采用丙酮进行提取。
流动相为甲醇：甲基叔丁基醚：水＝310：76：14
色谱柱：Symmetry C18
检测波长：450nm
二．保健食品中水溶性维生素分析方法概况
目前建立并推广了一套的系统分析方法，通过选用多波长离子对高效液相色谱分析可以解决维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺、维生素C的分析。生物素、泛酸、叶酸需采用单独的高效液相色谱分析条件。维生素B2采用荧光分光光度法分析。
1．维生素B1（盐酸硫胺、硝酸硫胺）
分析维生素B1可采用盐酸苯海拉明作为内标。样品采用甲醇+水+磷酸提取。
流动相为硫酸月桂酯钠溶液（5g/530mL）：乙腈：磷酸＝530：470：0.4
色谱柱：m-Bondapak C18或TSK Gel-C18
检测波长：260nm
2.维生素B1（呋喃硫胺）
有报道，呋喃硫胺是维生素B1的活性结构，在韩国、日本等产品中使用呋喃硫胺与盐酸硫胺、硝酸硫胺的色谱行为有较大区别。
流动相为甲醇：水：乙酸：PigB6＝450：530：20：20
色谱柱：m-Bondapak C18
检测波长：280nm
3.维生素B6（吡哆醇）、烟酸、烟酰胺
分析维生素B6、烟酸、烟酰胺可采用愈创木酚甘油醚作为内标。样品采用甲醇+水+磷酸提取。
流动相为1－癸烷磺酸钠溶液（1.22g/850mL）：乙腈：磷酸＝850：150：0.4
色谱柱：m-Bondapak C18或TSK Gel-C18
在维生素类保健食品中烟酸应用极少，基本上添加的均为烟酰胺。
检测波长：280nm
功能性饮料中添加的咖啡因和苯甲酸也可以同时检测。根据大量实验认为液体类样品应使用TSK Gel-C18，固体样品两者皆可。
4.维生素C
除颜色较深、含量较低、天然植物干制品外，一般样品中的维生素C均可以采用碘溶液滴定法进行测定。利用高效液相色谱法测定维生素C可利用维生素B6（吡哆醇）、烟酸、烟酰胺流动相体系，因维生素C色谱保留时间较短，可以将降低其中乙腈的比例至5%。提取溶剂尽可能使用水，以避免在前面出现倒峰影响定量结果的准确。
检测波长：254nm
5.维生素B2
有关维生素B2的色谱分析方法有报道，但在实际样品分析过程中因保留时间较短且与其它峰难以较好分离，故采用将其转化为光黄素后进行荧光分光光度法分析。
6.泛酸（维生素B3）
泛酸采用液相色谱分析法进行检测，样品用水提取即可。
流动相：0.02M磷酸二氢钾溶液：乙腈=95：5，pH=3.0
色谱柱： m- Bondapak C18 300mm
检测波长：200nm
7.生物素
生物素的分析正在初步摸索阶段，目前采用pH=3.5 0.25M磷酸盐缓冲溶液：甲醇=77：23的流动相，检测波长200nm。 目前的需要解决的问题是保留时间较长，大约在30min左右；此外灵敏度较低。
8.叶酸
叶酸一般使用弱碱性水溶液提取，为保证提取效果可以在50℃水浴中加热10min。
流动相：磷酸二氢钾缓冲溶液：甲醇=460:40，pH=6.0
色谱柱： m- Bondapak C18 300mm
检测波长：280nm
叶酸的研究方向：通过大量实际样品检测研究，发现在虫草等天然产物中存在与叶酸色谱保留时间完全一致的物质；不少样品中叶酸含量较低，拟采用固相萃取等技术作为前处理手段。
9.维生素B12
维生素B12的化学分析目前还是一个难题，对于含量较高，组成简单的原料和添加剂进行高效液相色笱单的原料和添加剂进行高效液相色失杂的多种维生素样品的分析方法正在摸索之中。
维生素B12的研究进展：虽然维生素B12有3个特征波长，但样品在不经处理的情况下也很难分析；在溶液中钴胺素很容易出现氰钴胺素、甲钴胺素、羟钴胺素等几种形式共存的现象。为避免出现上述问题，更好地去除样品中的干扰杂质并对样品中的维生素B12进行富集，目前采用加入表面活性物质、盐析、有机溶剂萃取等方法去除杂质，再通过固相萃取法进行富集的手段。
三、类维生素分析方法概况
1.肉碱（维生素BT）
肉碱若采用分光光度法检测比较繁杂，高效液相色谱法测定相对简单。利用高效液相色谱法测定肉碱同样利用维生素B6（吡哆醇）、烟酸、烟酰胺流动相体系，因肉碱色谱保留时间虽比维生素C长但相对仍较短，因此流动相可以同维生素C一样。提取溶剂尽可能使用水或pH=5~6的水，以避免在前面出现倒峰影响定量结果的准确。
检测波长：210nm
2.辅酶Q10
对于维生素类样品中辅酶Q10的检测采用液相色谱分析法。样品中辅酶Q10使用正己烷作为提取溶剂。
色谱柱：TSK Gel-C18
流动相：乙腈+四氢呋喃+水=55+40+5
检测波长：280nm
3.肌醇
对于维生素类样品中肌醇的检测建立了一套衍生化-气相色谱分析法。样品中肌醇经过提取，彻底去除水分后进行衍生化，正己烷提取后进行气相色谱分析。
衍生化试剂：三甲基氯硅烷：六甲基二硅氨烷：二甲基甲酰胺=1：2：8
色谱柱：BP-5弹性石英毛细管柱, 25m×0.32mm
色谱条件：载气 50mL/min
尾吹气 50 mL/min
氢气 40 mL/min
空气 500 mL/min
分流比 1：50
四、需要解决的问题及展望
1．解决样品前处理技术
（1）不少油性胶囊样品中加入了水溶性维生素，如何应用前处理手段解决提取、净化问题。
（2）对于含量较低的样品如何应用固相萃取等手段。
（3）对于目前原料微囊化制作技术如何应对。
2．解决色谱多组分分析技术
在目前现有的多组分分析技术的基础上，如何能将维生素B1并入维生素B6系列之中或创建新的流动相体系，再囊括维生素B2和叶酸等是今后研究的重要方面。
3. 解决分析过程快速化
在目前大量样品检测的基础上应归纳总结出样品前处理方法指南，确定样品组成和前处理方法之间的关系。
更多好文每日分享，欢迎关注公众号
【版权提示】观研报告网倡导尊重与保护知识产权。未经许可，任何人不得复制、转载、或以其他方式使用本网站的内容。如发现本站文章存在版权问题，烦请提供版权疑问、身份证明、版权证明、联系方式等发邮件至kf@chinabaogao.com，我们将及时沟通与处理。
